實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時(shí)，對(duì)其過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)的能力（即實(shí)時(shí)）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在熒光定量PCR(qPCR)中，反應(yīng)以循環(huán)中檢測(cè)到目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會(huì)越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測(cè)（也稱“讀板檢測(cè)”）測(cè)量的是PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

　　

　　熒光定量PCR將PCR擴(kuò)增和檢測(cè)合并為單一步驟。這樣就無需使用凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，更重要的是這一方法是真正定量的。在熒光定量PCR中，熒光染料被用來在熱循環(huán)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR儀器在反應(yīng)的對(duì)數(shù)期測(cè)定熒光信號(hào)的積累，獲得快速的PCR產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。

　　

　　熒光定量PCR分析常見術(shù)語：

　　

　　擴(kuò)增子：PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段

　　

　　擴(kuò)增曲線：根據(jù)熒光信號(hào)相對(duì)于循環(huán)數(shù)而制作的曲線

　　

　　基線：PCR起始時(shí)，熒光信號(hào)還未發(fā)生變化的幾個(gè)循環(huán)

　　

　　Ct（閾值循環(huán)）：熒光信號(hào)超過NTC（無模板對(duì)照樣品）固定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。用于對(duì)擴(kuò)增質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。

　　

　　核酸目標(biāo)：（也稱為“目標(biāo)模板”）——需要擴(kuò)增的DNA或RNA序列

　　

　　惰性參比染料：一種可作為內(nèi)部對(duì)照，以用于在數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)報(bào)告基團(tuán)染料信號(hào)進(jìn)行均一化的染料。均一化是對(duì)因濃度或體積變化而隨之引起波動(dòng)進(jìn)行的必要校正。所有的SDSPCR試劑盒都提供了參比熒光對(duì)照。

　　

　　Rn（均一化報(bào)告基團(tuán)）：報(bào)告基團(tuán)染料釋放的熒光強(qiáng)度除以惰性參比染料釋放的熒光強(qiáng)度

　　

　　Rn+：一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分，包括模板

　　

　　Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲?。?/div>